После окончания Заиконоспасского духовного училища в Москве, продолжил обучение в Московской духовной семинарии и затем поступил в Московский университет. В 1887 году успешно окончил историко-филологический факультет университета, защитив магистерскую диссертацию на тему "Александрия русских хронографов" (1893). В 1894 году провел исследования рукописей в библиотеках Белграда, Софии, Филиппополя, афонских монастырей и Праги, что позволило ему написать и успешно защитить докторскую диссертацию на тему "Откровение Мефодия Патарского и апокрифические видения Даниила" (1897).
Он начал свою академическую карьеру как приват-доцент Московского университета, где преподавал историю русского языка с 1891 по 1897 год. Затем он перешел на должность профессора в Новороссийском университете (ныне Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова), где он преподавал русский язык и словесность с 1897 по 1907 год. В Одессе он вступил в брак со своей студенткой Евгенией Самсоновной Кузьменко (Истриной) в 1906 году. Кузьменко также стала известным лингвистом-русистом и историком языка.
В своей роли профессора, он не ограничивался просто чтением лекций, но также выполнял обязанности инспектора, контролируя уровень преподавания литературы в гимназиях.
«…если бы теперь открылась возможность радикально преобразовать школу, то вряд ли можно ожидать быстрых и разительных успехов. Прежде всего, взгляды на реформы школы так разнообразны и защитники той или другой школы так между собой не сходятся, что все дело реформы свелось бы к тому, в чьих руках в данный момент очутилась бы власть. Практика, однако, показала, что такой способ проведения реформ не состоятелен. Поэтому и надежда на какую-то радикальную реформу школы есть надежда несостоятельная. <…> Одно должно признать несомненным, что дело преподавания, как дело живое, требует со стороны преподавателя постоянного к нему интереса и постоянного самоусовершенствования, а то и другое возможно только при достаточной свободе в своих действиях, при достаточном досуге, необходимом для самоусовершенствования, и при достаточном материальном обеспечении, дающем ему возможность пользоваться тем и другим».
С 1907 года он проработал в Петербургской Академии наук, где опубликовал несколько ценных статей о древнерусской литературе и апокрифах в журнале "Известия". Он также изучал литературу XIX века, включая творчество А.С. Пушкина.
В 1909 году он опубликовал небольшую статью под названием "День рождения Гоголя", в которой представил фотографии из метрической книги, подтверждающие, что дата рождения Н. В. Гоголя - 20 марта, а не 19-е, как обычно считалось.
Автором является специалист в изучении творчества и жизни писателей, таких как А. И. Тургенев (работы написаны в 1910, 1911, 1915), А. С. Кайсаров (1916), В. А. Жуковский (1911).
В период с 1920 по 1930 год была осуществлена публикация рукописи "Хроника Георгия Амартола в древнеславянорусском переводе" и проведено исследование этого произведения Истрином.
Участником Американской академии медиевистики стал в 1929 году.
Он был захоронен на кладбище, принадлежащем Смоленской православной церкви.
